כדי לבסס את ההרכב האיכותי של מוצרי מזון רבים, נעשה שימוש בתגובת הקסנטופרוטאינים לחלבון. נוכחות חומצות אמינו ארומטיות בתרכובת תיתן שינוי צבע חיובי לדגימת הבדיקה.
מהו חלבון
זה נקרא גם חלבון, שהוא חומר בנייה לאורגניזם חי. חלבונים שומרים על נפח השריר, משחזרים מבני רקמה פצועים ומתים של איברים שונים, בין אם זה שיער, עור או רצועות. בהשתתפותם, מיוצרים תאי דם אדומים, מווסת התפקוד התקין של הורמונים ותאי מערכת החיסון רבים.
זוהי מולקולה מורכבת, שהיא פוליפפטיד עם מסה גדולה מ-6103 דלתונים. מבנה החלבון נוצר משאריות חומצות אמינו בכמויות גדולות, המחוברות בקשר פפטיד.
מבנה חלבון
תכונה ייחודית של חומרים אלה בהשוואה לפפטידים במשקל מולקולרי נמוך הוא המבנה התלת מימדי המרחבי המפותח שלהם, הנתמך על ידי השפעות שונותמידת המשיכה. לחלבונים יש מבנה בן ארבע רמות. לכל אחד מהם מאפיינים משלו.
הארגון הראשוני של המולקולות שלהם מבוסס על רצף חומצות האמינו, שהמבנה שלה מזוהה על ידי תגובת הקסנטופרוטאין לחלבון. מבנה כזה הוא קשר פפטיד שחוזר על עצמו מעת לעת -HN-CH-CO-, ורדיקלי השרשרת הצדדית בחומצות אמינו-קרבוקסיליות הם החלק הסלקטיבי. הם אלה שקובעים את תכונות החומר בכללותו בעתיד.
מבנה החלבון הראשוני נחשב חזק מספיק, זאת בשל נוכחותם של אינטראקציות קוולנטיות חזקות בקשרי פפטיד. היווצרות רמות עוקבות מתרחשת בהתאם לסימנים שנקבעו בשלב הראשוני.
היווצרות מבנה משני אפשרית עקב פיתול רצף חומצות האמינו לספירלה, שבה נוצרים קשרי מימן בין הסיבובים.
רמת הארגון השלישונית של מולקולה נוצרת כאשר חלק אחד של הסליל מונח על גבי שברים אחרים עם הופעת כל מיני קשרים ביניהם, עם תרכובת מימן, דיסולפיד, קוולנטי או יונית. התוצאה היא אסוציאציות בצורה של כדוריות.
הסידור המרחבי של מבנים שלישוניים עם יצירת קשרים כימיים ביניהם מוביל להיווצרות הצורה הסופית של המולקולה או הרמה הרבעונית.
חומצות אמינו
הם קובעים את התכונות הכימיות של חלבונים. יש בערך 20 חומצות אמינו עיקריות,נכלל בהרכב הפוליפפטידים ברצפים שונים. זה כולל גם חומצות אמינו-קרבוקסיליות נדירות בצורה של הידרוקסיפרולין והידרוקסיליזין, שהן נגזרות של פפטידים בסיסיים.
כסימן לתגובת הקסנטופרוטאינים של זיהוי חלבונים, נוכחותן של חומצות אמינו בודדות מעניקה שינוי בצבע הריאגנטים, מה שמרמז על נוכחות של מבנים ספציפיים בהרכבם.
כפי שהתברר, כולן חומצות קרבוקסיליות, שבהן אטום המימן הוחלף בקבוצת אמינו.
דוגמה למבנה של מולקולה היא נוסחת המבנה של גליצין (HNH− HCH− COOH) בתור חומצת האמינו הפשוטה ביותר.
במקרה זה, ניתן להחליף את אחד המימנים CH2- פחמן ברדיקל ארוך יותר, כולל טבעת בנזן, אמינו, סולפו, קבוצות קרבוקסיות.
מה המשמעות של תגובת הקסנטופרוטאינים
לניתוח חלבון איכותי נעשה שימוש בשיטות שונות. אלה כוללים תגובות:
- ביורט עם צבע סגול;
- נינהידרין ליצירת תמיסה כחולה-סגולה;
- פורמלדהיד עם מכתים אדום;
- נייר כסף עם משקעים אפור-שחור.
כאשר מבצעים כל שיטה, מוכחים נוכחות של חלבונים ונוכחות של קבוצה תפקודית מסוימת במולקולה שלהם.
יש תגובה של קסנטופרוטאינים לחלבון. זה נקרא גם מבחן מאלדר. זה מתייחס לתגובות צבע על חלבונים, בשהן חומצות אמינו ארומטיות והטרוציקליות.
תכונה של בדיקה כזו היא תהליך הניטרציה של שאריות חומצות אמינו מחזוריות עם חומצה חנקתית, בפרט, הוספת קבוצת ניטרו לטבעת הבנזן.
התוצאה של תהליך זה היא היווצרות של תרכובת ניטרו, המשקעת. זהו הסימן העיקרי לתגובת קסנטופרוטאינים.
אילו חומצות אמינו נקבעות
לא ניתן לזהות את כל החומצות האמינו-קרבוקסיליות באמצעות בדיקה זו. המאפיין העיקרי של תגובת הקסנטופרוטאין של זיהוי חלבון הוא נוכחות של טבעת בנזן או הטרו-מחזור במולקולת חומצת האמינו.
מחומצות אמינו-קרבוקסיליות חלבוניות מבודדות שתי חומצות ארומטיות, שבהן יש קבוצת פניל (בפנילאלנין) ורדיקל הידרוקסיפניל (בטירוזין).
תגובת הקסנטופרוטאין משמשת לקביעת חומצת האמינו ההטרוציקלית טריפטופן, בעלת גרעין אינדול ארומטי. נוכחות התרכובות הנ ל בחלבון נותנת שינוי צבע אופייני של המדיום הנבדק.
באיזה ריאגנטים משתמשים
כדי לבצע את תגובת הקסנטופרוטאינים, תצטרך להכין תמיסה של 1% של ביצה או חלבון צמחי.
בדרך כלל משתמשים בביצת עוף, שנשברת כדי להפריד עוד יותר את החלבון מהחלמון. כדי לקבל תמיסה, 1% חלבון מדולל פי עשרה מכמות המים המטוהרים. לאחר המסת החלבון, יש לסנן את הנוזל שנוצר דרך מספר שכבות של גזה.יש לאחסן את הפתרון הזה במקום קריר.
ניתן לבצע את התגובה עם חלבון צמחי. להכנת התמיסה משתמשים בקמח חיטה בכמות של 0.04 ק ג. הוסף 0.16 ליטר מים מטוהרים. המרכיבים מעורבבים בבקבוק, אשר מונח במשך 24 שעות במקום קר בטמפרטורה של כ + 1 מעלות צלזיוס. לאחר יום מנערים את התמיסה, ולאחר מכן מסננים אותה תחילה עם צמר גפן, ולאחר מכן עם מסנן קפלי נייר. הנוזל שנוצר נשמר במקום קר. בפתרון כזה יש בעיקר שבר אלבומין.
כדי לבצע את תגובת הקסנטופרוטאינים, חומצה חנקתית מרוכזת משמשת כמגיב העיקרי. ריאגנטים נוספים הם תמיסה של 10% נתרן הידרוקסיד או אמוניה, תמיסת ג'לטין ופנול לא מרוכז.
מתודולוגיה
למבחנה נקייה הוסף תמיסה של 1% חלבון ביצה או קמח בכמות של 2 מ ל. מוסיפים לו כ-9 טיפות של חומצה חנקתית מרוכזת כדי למנוע את נפילת הפתיתים. התערובת המתקבלת מחוממת, כתוצאה מכך, המשקע הופך צהוב ונעלם בהדרגה, וצבעו נכנס לתמיסה.
כשהנוזל מתקרר מוסיפים למבחנה לאורך הדופן כ-9 טיפות של נתרן הידרוקסיד מרוכז, המהווה עודף לתהליך. התגובה של המדיום הופכת לבסיסית. התכולה בשפופרת הופכת לכתום.
תכונות
מכיוון שקסנטופרוטאין נקרא תגובה איכותית לחלבונים מתחתעל ידי פעולת חומצה חנקתית, אז הבדיקה מתבצעת מתחת למנדף הכלול. ציית לכל אמצעי הבטיחות בעת עבודה עם חומרים קאוסטיים מרוכזים.
בתהליך החימום עלולה להישפך תכולת הצינור, דבר שיש לקחת בחשבון בעת קיבועו במחזיק ובחירת נטייה.
נטילת חומצה חנקתית מרוכזת ונתרן הידרוקסיד צריכה להיעשות רק עם פיפטת זכוכית ונורת גומי, אסור להקליד בפה.
תגובה השוואתית עם פנול
כדי להמחיש את התהליך ולאשר את נוכחותה של קבוצת הפניל, מבוצעת בדיקה דומה עם הידרוקסיבנזן.
הכנס 2 מ"ל של פנול מדולל למבחנה, ולאחר מכן הוסף בהדרגה לאורך הקיר 2 מ"ל של חומצה חנקתית מרוכזת. התמיסה נתונה לחימום, וכתוצאה מכך היא הופכת לצהובה. תגובה זו היא איכותית לנוכחות של טבעת בנזן.
תהליך הניטרציה של הידרוקסיבנזן עם חומצה חנקתית מלווה ביצירת תערובת של פרניטרופנול ואורתוניטרופנול ביחס אחוז של 15 ל-35.
השוואת ג'לטין
כדי להוכיח שתגובת הקסנטופרוטאינים לחלבון מזהה רק חומצות אמינו בעלות מבנה ארומטי, משתמשים בחלבונים שאין להם קבוצה פנולית.
הכנס תמיסת ג'לטין 1% בכמות של 2 מ ל למבחנה נקייה. מוסיפים לו כ-9 טיפות של חומצה חנקתית מרוכזת. התערובת שהתקבלה מחוממת. הפתרון לא הופך לצהוב, מה שמוכיח את ההיעדרחומצות אמינו בעלות מבנה ארומטי. לעיתים נצפה הצהבה קלה של המדיום עקב נוכחותם של זיהומי חלבון.
משוואות כימיות
תגובת הקסנטופרוטאינים לחלבונים מתרחשת בשני שלבים. הנוסחה של השלב הראשון מתארת את תהליך הניטרציה של מולקולת חומצת אמינו באמצעות חומצה חנקתית מרוכזת.
דוגמה לכך היא הוספת קבוצת ניטרו לטירוזין ליצירת ניטרוטירוזין ודיניטרוטירוזין. במקרה הראשון, רדיקל NO2 אחד מחובר לטבעת הבנזן, ובמקרה השני שני אטומי מימן מוחלפים ב-NO2. הנוסחה הכימית של תגובת הקסנטופרוטאין מיוצגת על ידי האינטראקציה של טירוזין עם חומצה חנקתית ליצירת מולקולת ניטרוטירוזין.
תהליך הניטרציה מלווה במעבר של צבע חסר צבע לגוון צהוב. כאשר מבצעים תגובה דומה עם חלבונים המכילים שאריות חומצות אמינו של טריפטופן או פנילאלנין, גם צבע התמיסה משתנה.
בשלב השני, תוצרי הניטרציה של מולקולת הטירוזין, בפרט ניטרוטירוזין, מתקשרים עם אמוניום או נתרן הידרוקסיד. התוצאה היא מלח נתרן או אמוניום, שצבעו צהוב-כתום. תגובה זו קשורה ליכולת של מולקולת הניטרוטירוזין לעבור לצורת הקינואיד. מאוחר יותר, נוצר ממנו מלח של חומצה ניטרונית, שיש לה מערכת כינונים של קשרים מצומדים כפולים.
כך מסתיימת תגובת הקסנטופרוטאינים לחלבונים. משוואה שתייםהשלב מוצג למעלה.
תוצאות
במהלך ניתוח של נוזלים הכלולים בשלוש מבחנות, פנול דליל משמש כתמיסת ייחוס. חומרים עם טבעת בנזן נותנים תגובה איכותית עם חומצה חנקתית. כתוצאה מכך, צבע הפתרון משתנה.
כפי שאתה יודע, ג'לטין כולל קולגן בצורה הידרוליזה. חלבון זה אינו מכיל חומצות אמינו-קרבוקסיליות ארומטיות. בעת אינטראקציה עם חומצה, אין שינוי בצבע המדיום.
במבחנה השלישית, נצפית תגובה חיובית של קסנטופרוטאין לחלבונים. ניתן להסיק את המסקנה כדלקמן: כל החלבונים בעלי מבנה ארומטי, בין אם זה קבוצת פניל או טבעת אינדול, נותנים שינוי צבע לתמיסה. זה נובע מהיווצרות תרכובות ניטרו צהובות.
ביצוע תגובת צבע מוכיח את נוכחותם של מגוון מבנים כימיים בחומצות אמינו וחלבונים. דוגמה לג'לטין מראה שהוא מכיל חומצות אמינו-קרבוקסיליות שאין להן קבוצת פניל או מבנה מחזורי.
תגובת הקסנטופרוטאינים יכולה להסביר את הצהבה של העור כאשר מורחים עליו חומצה חנקתית חזקה. קצף חלב יקבל את אותו צבע כאשר יתבצע איתו ניתוח כזה.
בפרקטיקה במעבדה רפואית, דגימת צבע זו אינה משמשת לזיהוי חלבון בשתן. זה נובע מהצבע הצהוב של השתן עצמו.
תגובת הקסנטופרוטאינים הפכה בשימוש יותר ויותר לכימות חומצות אמינו כגון טריפטופן וטירוזין בחלבונים שונים.
