כרומטוגרפיה היא אחת השיטות להפרדת חומרים. הוא משמש לניתוח איכותני וכמותי שלאחר מכן של התכונות הפיזיקליות והכימיות של מיקרו-חלקיקים. וריאציה של טכנולוגיה זו היא כרומטוגרפיה זיקה. הרעיון להבדיל בין תרכובות חלבון באמצעות תכונת הזיקה המולקולרית ידוע במדע כבר כמה עשורים. עם זאת, הוא קיבל את הפיתוח שלו רק בשנים האחרונות, לאחר הכנסת חומרים הידרופיליים נקבוביים ביותר המשמשים כמטריצה. שיטה זו מאפשרת לפתור הן בעיות אנליטיות (הפרדת חומרים וזיהוים) והן בעיות הכנה (טיהור, ריכוז).
Essence
כרומטוגרפיה זיקה (מהמילה הלטינית affinis - "סמוך", "קשורה") מבוססת על אינטראקציות זיקה, שהן יצירת קשרים ספציפיים מאוד בין מולקולת מרווח (ליגנד או אפיננט) לבין מולקולת מטרה. מנגנונים אלו נפוצים בטבעם (חיבור של מתווכים או הורמונים ורצפטורים, נוגדנים ואנטיגנים, הכלאה של פולינוקלאוטידים וסוגים אחרים של תהליכים). ברפואה, כרומטוגרפיית זיקה משמשת למטרות מעשיות מאז 1951
הרכיבים מופרדים באופן הבא:
- תמיסת עבודה המכילה את החומר המיועד לבידוד מועברת דרך הסורבנט;
- ליגנד המופקד על המטריצה הסורבנטית שומר על החומר הזה;
- זה מרוכז (צבירה);
- חילוץ החומר המבודד מהסופג על ידי שטיפה עם ממס.
שיטה זו מאפשרת לך לבודד תאים שלמים. ההבדל מכרומטוגרפיית ספיגה מסורתית הוא שישנה קישור ביוספציפי חזק של הרכיב המבודד לסופג, המתאפיין בסלקטיביות גבוהה.
סופחים
החומרים הבאים משמשים כסופחים:
- תרכובות ג'ל על בסיס אגרוז, פוליסכריד המתקבל מאגר. הנפוץ ביותר בשימוש הם 3 זנים: Sepharose 4B, CL (אגרוז צולב) ואפי-ג'ל. הרכב האחרון הוא ג'ל שונה של agarose ו-polyacrylamide. יש לו אינרטיות ביולוגית גדולה יותר, עמידות כימית ותרמית גבוהה.
- סיליקה (סיליקה ג'ל).
- Glass.
- פולימרים אורגניים.
כדי להעלים מכשולים מכניים במהלך מגע עם ליגנד, משתמשים בחומרים נוספים כדי להפריד אותו מהנשא (פפטידים, דיאמינים, פוליאמינים, אוליגוסכרידים).
ציוד
ציוד כרומטוגרפיה זיקה כולל את היחידות העיקריות הבאות:
- מיכלי אחסון לשלב הנייד (פלט);
- משאבות בלחץ גבוה לאספקה בינונית (לרוב בהדדיות);
- מסנן לניקוי חומרי eluent מאבק;
- מכשיר מינון;
- עמודה כרומטוגרפית להפרדת תערובת;
- גלאי לזיהוי רכיבים מופרדים היוצאים מהעמודה;
- מקליטי כרומטוגרמה ויחידת מיקרו-מעבד (מחשב).
על מנת להפחית את כמות האוויר המומס, הליום מועבר תחילה דרך השלב הנייד. כדי לשנות את הריכוז של eluent, מותקנות מספר משאבות הנשלטות על ידי המתכנת. עמודות כרומטוגרפיות עשויות מפלדת אל חלד (לדרישות מוגברות לעמידות בפני קורוזיה), זכוכית (אופציה אוניברסלית) או אקריליק. למטרות הכנה, הקוטר שלהם יכול להשתנות בין 2 ל-70 ס מ. בכרומטוגרפיה אנליטית משתמשים במיקרו-עמודות Ø10-150 מיקרומטר.
כדי להגביר את רגישות הגלאים, מכניסים לתערובת ריאגנטים התורמים ליצירת חומרים הבולטים יותר קרניים באזור האולטרה-סגול או הנראה של הספקטרום.
מתודולוגיה
ישנם 2 סוגים עיקריים של כרומטוגרפיית זיקה נוזלית:
- עמודה, שבה ממלאים את העמוד בפאזה נייחת ומעבירים דרכו תערובת בזרימהמחסל. הפרדה יכולה להתרחש תחת לחץ או תחת כוח הכבידה.
- שכבה דקה. הפלט נע לאורך שכבת הסופח השטוחה בהשפעת כוחות נימיים. הסופח מיושם על צלחת זכוכית, מוט קרמיקה או קוורץ, רדיד מתכת.
שלבים עיקריים של העבודה כוללים:
- הכנת הסופח, קיבוע הליגנד על הנשא;
- הזנת תערובת ההפרדה לעמודה הכרומטוגרפית;
- טעינת פאזה ניידת, קשירת רכיבים באמצעות ליגנד;
- החלפת שלב לבידוד החומר הקשור.
Destination
כרומטוגרפיה זיקה משמשת לבידוד סוגי החומרים הבאים (סוג הליגנד שבו נעשה שימוש מצוין בסוגריים):
- אנלוגים של מעכבים אנזימטיים, מצעים וקו-פקטורים (אנזימים);
- חומרים ביו-אורגניים עם סימני זרות גנטית, וירוסים ותאים (נוגדנים);
- פחמימות במשקל מולקולרי גבוה, פולימרים חד-סוכרים, גליקופרוטאין (לקטינים);
- חלבונים גרעיניים, נוקלאוטידילטרנספראזות (חומצות גרעין);
- רצפטורים, חלבוני הובלה (ויטמינים, הורמונים);
- חלבונים באינטראקציה עם קרומי התא (תאים).
הטכנולוגיה הזו משמשת גם להשגת אנזימים משותקים, וקשירתם לתאית מאפשרת ייצור של חומרים אימונוסורבים.
כרומטוגרפיה של חלבונים קושרי DNA
בידוד של חלבונים קושרים DNA מתבצע באמצעותהפרין. גליקוזאמינוגליקן זה מסוגל לקשור מגוון רחב של מולקולות. כרומטוגרפיית זיקה של חלבונים מקבוצה זו משמשת לבידוד חומרים כגון:
- גורמי התחלה והתארכות של תרגום (סינתזה של מולקולות וחלבונים של חומצת גרעין);
- restrictases (אנזימים המזהים רצפים מסוימים ב-DNA דו-גדילי);
- ליגזות ופולימראזות של DNA (אנזימים המזרזים את החיבור של שתי מולקולות ליצירת קשר כימי חדש ומעורבים בשכפול ה-DNA);
- מעכבי סרין פרוטאז הממלאים תפקיד חשוב בתהליכים חיסוניים ודלקתיים;
- גורמי גדילה: פיברובלסט, Schwann, אנדותל;
- חלבונים של מטריצה תאית;
- קולטני הורמונים;
- lipoproteins.
Dignity
שיטה זו היא אחת הספציפיות ביותר לבידוד של תרכובות תגובתיות (אנזימים ואגרגטים גדולים יותר - וירוסים). עם זאת, הוא משמש לא רק כדי לבודד חומרים פעילים ביולוגית.
זיהוי של נוגדנים בכמויות קטנות, הערכה כמותית של חומצה פוליאדנילית, קביעה מהירה של המסות המולקולריות של דהידרוגנאזות, הסרת מזהמים מסוימים, חקר הקינטיקה של ההפעלה של הצורה הלא פעילה של טריפסין, המבנה המולקולרי של האדם אינטרפרונים - זו לא כל רשימת המחקרים בהם נעשה שימוש בזיקה.כרומטוגרפיה. השימוש במרפאה נובע מיתרונותיה כגון:
- יכולת ניקוי יעילהחלבונים, פוליסכרידים, חומצות גרעין. הם שונים מעט בתכונות הפיזיקליות והכימיות שלהם ומאבדים פעילות במהלך הידרוליזה, דנטורציה וסוגי טיפול אחרים המשמשים בשיטות אחרות.
- מהירות ההפרדה של חומרים, האופי הדינמי של התהליך.
- אין צורך לטיהור אנזים מיוחד והומוגנית איזואנזים לקביעת קבועי דיסוציאציה.
- יכול להפריד מגוון רחב של חומרים.
- צריכה נמוכה של ליגנדים.
- אפשרות להפרדה של חומרים בנפחים גדולים.
- תהליך הפיך של קישור מקרומולקולות ביולוגיות.
ניתן לשלב טכניקה זו עם אחרות, כדי לכפות שדה נוסף (כבידה, אלקטרומגנטי). זה מאפשר לך להרחיב את היכולות הטכניות של כרומטוגרפיה.
הנדסה אנזימטית
הודות לשיטה זו, החל הפיתוח הפעיל של ענף חדש של ביוטכנולוגיה - הנדסת אנזימים.
לכרומטוגרפיה זיקה לבידוד אנזימים יש את היתרונות הבאים:
- השגת אנזימים בכמויות גדולות כתוצאה מפחות זמן, כתוצאה מכך - הוזלתם במחיר;
- אימוביליזציה של אנזימים יכולה להרחיב משמעותית את היקף היישום שלהם ברפואה ובתעשייה;
- הקשר של אנזימים עם תומך מוצק בלתי מסיס מאפשר לחקור את השפעת המיקרו-סביבה ואת כיוון התגובות, הממלאות תפקיד חשוב בתהליכים טבעיים ופיזיולוגיים.
