Flow cytometry היא שיטת מחקר ציטולוגית המשמשת לניתוח מעמיק של תאים. היתרון שלו הוא שהוא מאפשר לך ללמוד כל תא בנפרד. סוג זה של ניתוח עוזר להעריך מספר פרמטרים במאות תאים תוך שניות. כתוצאה מכך, ציטופלואורמטריה נחשבת לאחת משיטות הניתוח המהירות והמדויקות ביותר הזמינות כיום למדענים ולרופאים.
עיקרון
העיקרון של ציטומטריית זרימה מבוסס על מדידת פיזור אור וזוהר (פלורסנטיות) של תאים. תרחיף התא מועבר כזרם במהירות גבוהה דרך תא הציטומטר, שם הוא מוקרן בלייזר. גם מיקוד הידרודינמי כביכול מתבצע שם. המנגנון שלו הוא שהזרימה מהתא עם החלקיקים הנחקרים ביציאה זורמת לתוך הסילון החיצוני, שמהירותו גבוהה יותר. כתוצאה מכך, חלקיקים מיושרים בשרשרת מסודרת.
תאים מראש מסומנים בצבעי פלורסנט מיוחדים (פלואורוכרומים). הודות להם, קרן הלייזרמעורר זוהר משני. אותות האור המתקבלים נרשמים על ידי גלאים. לאחר מכן, המידע מעובד באמצעות אלגוריתמי תוכנה המאפשרים לספור אוכלוסיות תאים בודדות השונות בכמה קריטריונים.
מחקר במיקרוסקופיה קונבנציונלית לרוב לא מצליח להבחין בין תאים שונים כי הם נראים אותו הדבר. ציטופלואורמטריה יכולה לספק נתונים אחרים (שלמות מבנה ה-DNA), לנתח ביטוי חלבון, הישרדות תאים.
מכיוון שעירור של פלואורכרומים דורש קרני אור בעלות אורכי גל שונים, כמו גם סוגים שונים של גלאים, מתקנים מודרניים מצוידים במספר ערוצי זיהוי (מ-4 עד 30). מספר פולטי הלייזר יכול להיות בין 1 ל-7. מכשירים מורכבים יותר מאפשרים מחקרים מרובי פרמטרים של מספר תכונות של חלקיקים בו-זמנית.
יתרונות וחסרונות
היתרונות של ציטומטריית זרימה כוללים:
- מהירות עיבוד גבוהה (רישום של עד 30 אלף אירועים בשנייה אחת);
- אפשרות לחקור מספר רב של תאים (עד 100 מיליון במדגם);
- כימת עוצמת האור הפלורסנט;
- ניתוח של כל תא;
- מחקר סימולטני של תהליכים הטרוגניים;
- הפרדה אוטומטית של נתונים לפי אוכלוסיות תאים;
- הדמיה איכותית של תוצאות.
תכונה נוספת של הטכנולוגיה הזו היא זוניתן לצבוע את החלקיק המנותח במספר תמיסות ניאון. הודות לכך, מתרחש מחקר מרובה פרמטרים.
החסרונות כוללים את מורכבות הציוד הטכני והצורך בהכנה מיוחדת לדוגמא.
ציטומטרים
המכשירים הראשונים מסוג זה הופיעו כבר ב-1968 בגרמניה, אך הם התפשטו הרבה מאוחר יותר. נכון לעכשיו, ניתן לחלק את כל המכשירים הפועלים בשיטת ציטומטריית זרימה ל-2 סוגים:
- מכשירים המודדים קרינה פלואורסצנטית (שני אורכי גל או יותר), פיזור אור של 10° ו-90° (גלאי זווית נמוכה ופיזור צד);
- מכשירים שבנוסף למדידת מספר פרמטרים סלולריים, ממיינים אוטומטית לקבוצות לפי קריטריונים אלה.
גלאי הפיזור קדימה נועד לקבוע את גודל התא, ומכשיר הפיזור הצידי מאפשר לקבל מידע על נוכחות של גרגירים תוך-תאיים, יחס הנפח של הציטופלזמה והגרעין.
ציטומטרים קלאסיים, בניגוד למיקרוסקופי אור, אינם מאפשרים לקבל תמונה של תא. עם זאת, בשנים האחרונות פותחו מכשירים משולבים המסוגלים לשלב את היכולות של מיקרוסקופ וציטופלורימטר. הם יידונו להלן.
ציטומטרי הדמיה
למכשירים המשמשים בציטומטריית זרימה קלאסית,תכונה אחת אופיינית: אם אירועים נדירים נרשמים באוכלוסיית התאים המנותחים, אז אין דרך להעריך מה המהות שלהם. חלקיקים אלה יכולים להיות שרידים של תאים מתים או קבוצה נדירה שלהם. במכשירים קונבנציונליים, נתונים כאלה אינם נכללים בזרימת האירועים הכללית, אך הם יכולים להיות בעלי ערך מיוחד עבור ניתוח מדעי וקליני.
הדור החדש של ציטומטרי זרימת הדמיה מאפשר לך ללכוד תמונה של כל תא שעובר בזרימה דרך אזור הגלאי. קל לראות אותו על ידי לחיצה על האזור המתאים בתרשים, המוצג על צג המחשב.
אזורי יישום
ציטומטריית זרימה היא שיטה אוניברסלית המשמשת בתחומים רבים של רפואה ומדע:
- אימונולוגיה;
- אונקולוגיה;
- transplantology (השתלת מח עצם אדום, תאי גזע);
- hematology;
- toxicology;
- ביוכימיה (מדידה של חומציות בתוך התא, חקר פרמטרים אחרים);
- פרמקולוגיה (יצירת תרופות חדשות);
- microbiology;
- טפילולוגיה ווירולוגיה;
- אוקיאנולוגיה (המחקר של פיטופלנקטון כדי להעריך את מצב גופי המים ומשימות אחרות);
- ננוטכנולוגיה וניתוח מיקרו-חלקיקים.
אימונולוגיה
מערכת החיסון האנושית מורכבת ממגוון רחב של תאים. ציטומטריית זרימה באימונולוגיה מאפשרת להעריך את המבנה והתפקודים שלהם, כלומר לבצע מורפופונקציונליותניתוח.
מחקר כזה עוזר להבין את האופי המורכב של חסינות. פנוטיפים של תאים משתנים כתוצאה מהפעלה על ידי אנטיגנים, התפתחות פתולוגיות וגורמים נוספים. ציטופלואורומטריה יכולה להפריד תת-אוכלוסיות של תאי חיסון בתערובת מורכבת ולהעריך את כל השינויים שלהם לאורך זמן.
אונקולוגיה
אחת המשימות החשובות ביותר באונקולוגיה היא התמיינות התאים לפי סוגם. עקרון הניתוח באמצעות ציטומטריית זרימה באונקהמטולוגיה מבוסס על התופעה הבאה: כאשר דגימה מטופלת בצבע ניאון מיוחד, היא נקשרת לחלבונים ציטופלזמיים. לאחר חלוקה בתאים מתרבים באופן פעיל, התוכן שלו יורד בחצי. בהתאם לכך, עוצמת זוהר התא פוחתת פי שניים.
ישנן דרכים אחרות לזהות תאים מתרבים:
- שימוש בצבעים קושרי DNA (פרופידיום יודיד);
- שימוש ב-uracil המסומן;
- רישום של רמת ביטוי מוגברת של חלבוני ציקלין, המעורבים בוויסות מחזור התא.
