PCR, או תגובת שרשרת פולימראז, היא טכניקת מעבדה מתוחכמת שנמצאת בשימוש נרחב ברפואה ובתחומים מדעיים אחרים. אבחון PCR הפך בזמנו לפריצת דרך אמיתית במדע.
Description
PCR כמותי הוא סוג של PCR בזמן אמת.
זה מובן כגרסה של PCR, שבה הקינטיקה של התגובה מתועדת כל הזמן, מה שמאפשר להעריך באופן איכותי את התוכן של רצפי נוקלאוטידים DNA ספציפיים בתערובת מולקולרית מורכבת.
שיטת PCR כמותית תידון בפירוט רב יותר להלן.
מהות הניתוח
שיטות תרבותיות וסרולוגיות משמשות לעתים קרובות במיוחד לאבחון זיהומים. תחת הראשון, נקבעים נוגדנים לפתוגן זיהומי בסרום הדם. בשנייה, נעשה שימוש בחומר ביולוגי שנלקח מאדם חולה כדי לזרוע מצע ספציפי המתאים לצמיחת מושבות פתוגנים. אבחון בשניהםמקרה עשוי להימשך ימים או שבועות.
ניתן לבצע בדיקת PCR עם חומרים ביולוגיים שונים שמתקבלים מאדם חולה. דם ואמצעים ונוזלים פתולוגיים, פיזיולוגיים וביולוגיים אחרים משמשים כדגימות. אתה יכול לעשות צואה או שתן PCR.
זיהומים לא טיפוסיים וויראליים מאובחנים לרוב על ידי PCR כמותי, מכיוון שהם עשויים שלא להיות קלים לאבחון בשל האופי הספציפי של התהליך הפתולוגי הנגרם על ידם. כדי לקבוע זיהומים כאלה, לוקח זמן, שבמהלכו מתחילים להיווצר נוגדנים בגוף, הנקבעים בשיטות סרולוגיות. אבל זה לא מקובל במקרים מסוימים.
שיטת הביצוע
שיטת PCR - זיהוי זיהום במעבדה בדגימות שבודדו מהמטופל (במבחנה).
כדי לבצע תגובת שרשרת פולימראז, יש צורך בסט של ריאגנטים מיוחדים.
חומר הבדיקה מוכנס למבחנות עם ריאגנטים. המבחנות ממוקמות במתקן מיוחד - מגבר PCR, אשר נועד להגביר (להגדיל את מספר) של קטעי ה-RNA או ה-DNA הרצויים, מגבר ה-PCR פועל במצב מחזורי. בכל מחזור, אם הדגימות מכילות את רצף ה-RNA או ה-DNA של הפתוגן, אז יותר ויותר עותקים של חלקיקי חומצות הגרעין הללו מצטברים בתמיסה. אתה יכול לקבוע את נוכחות הפתוגן, ואת כמותו בדגימות.
סוגי PCR
ניתוח איכותי על ידי PCR מאפשר לך לקבל את התוצאה הבאה:
- שלילי כאשר הפתוגן המעניין אינו נמצא בדגימות;
- חיובי אם בדגימות נמצאו רצפים האופייניים לפתוגן מסוים.
עם תוצאת PCR חיובית, נוכל לדבר בדיוק של 95% על נוכחות של זיהום מאובחן. במקביל, הדיוק של ערכות PCR המשמשות למטרות אבחון מגיע ל-100%.
בדרך כלל 5% מהתוצאות השגויות נקבעות על ידי הגורם האנושי. לדוגמה, הפרות של טכניקת הניתוח והאחסון של ריאגנטים יכולות להפחית באופן משמעותי את דיוק המחקר.
PCR כמותי מגדיר את הרעיון של עומס ויראלי. ניתן לקבוע כמה סטים של DNA פתוגן היו בדגימות שנלקחו מהמטופל.
חומרת הזיהום עומדת ביחס ישר לעלייה במספרם. אתה יכול גם לקבוע את הצלחת הטיפול להפחתת העומס הנגיפי.
הגשה עבור חומר ביולוגי PCR
PCR כמותי מתבצע במרפאה, בעיקר בשעות הבוקר. בביקור אצל הרופא יאמר למטופל מה צריך לקחת: גרידה, מריחות, שתן או דם. PCR יכול לזהות פתוגנים ללא קשר לרמת הזיהום של החומר.
לניתוח חיובי, בתיאוריה, נדרשת נוכחות של פתוגן אחד בלבד בדגימות. בפועל הם מנסים ליצור תנאים נוחים עוד יותר. יש כמה המלצות לכך:
- אם הם לוקחים גרידה או ספוגית מאיברי המיןאיברים, עליך להימנע מקיום יחסי מין אינטימיים שלושה ימים לפני המחקר;
- אינך יכול להתחכך בתרופות אנטיבקטריאליות או לשטוף את עצמך לפני הניתוח;
- שלוש שעות לפני נטילת מריחה מהשופכה, עליכם להתאזר בסבלנות ולא לרוקן את המעיים.
אל תפעל לפי הכללים האלה בעת תרומת דם.
איך מתפרשות התוצאות של ניתוח PCR כמותי?
הערכה כמותית של התוצאות שהתקבלו
במספר מצבים קליניים מופיעה בעיית יעילות הטיפול ו/או הדינמיקה של התהליך הפתולוגי. שאלות כאלה רלוונטיות במיוחד כאשר בוחנים אנשים עם זיהומים כרוניים (נגיף כשל חיסוני אנושי, הפטיטיס B ו-C). בעת אבחון, הם מבוססים על העובדה שהצטברות של אמפליקונים (תוצרי PCR) היא פרופורציונלית לנוכחות של עותקים של הגן הרצוי בדגימה המנותחת.
כמובן, בהתחשב בתוצאות של PCR כמותי נעשה על ידי אלקטרופורזה ג'ל עם לימוד עוצמת אותות PCR מיוחדים. כמו כן, תנאי מוקדם להערכה כמותית נכונה של התוצאות המתקבלות הוא דגימות ביקורת אמינות חיוביות המכילות מספר ידוע של עותקים של הגן הרצוי (לדוגמה, אלף עותקים של הגן הפטיטיס C עבור תגובת PCR אחת). מספר דילולים סדרתיים של הבקרה הכמותית מאפשרים ליצור עקומות כיול ומשמשים להערכת התוכן של גנוקופים קליניים בדגימות קליניות.
בהגדרה של PCR כמותי, הישג מרכזי היה היצירהבדיקות DNA פלואורסצנטיות שמתווספות לתערובת התגובה בו זמנית עם פריימרים פשוטים ומאפשרות לך לעקוב אחר תהליך ה-PCR בזמן, כלומר, PCR בזמן אמת.
מתודולוגיית TaqMan מתייחסת לסינתזה של בדיקות DNA פלואורסצנטיות שהן ספציפיות לחלק האמצעי של האמפליקון ויש להן שתי תוויות בקצוות. אחת מהן היא תווית ניאון, השנייה היא מולקולת מרווה עבור הקרינה הזו.
מכשיר מיוחד, שהוא הכלאה של מד פלואור ומגבר תרמובלוק, מבצע מדידות קבועות של הקרינה בכל מבחנה (עקרון PCR בזמן אמת). לאחר 20-40 מחזורי PCR, יתקבלו עקומות בודדות עבור כל דגימה. ניתן לחשב את מספר העותקים של הגן הרצוי הכלול בדגימת הבדיקה מעקומות כיול עם דגימות בקרה.
כמו כן, מאפיין חשוב ביישום PCR בשיטת הפלורסנט הוא שאין צורך לפתוח צינורות עם תערובת PCR כאשר לוקחים בחשבון את התוצאות. זה מפחית את האפשרות של זיהום החדר עם מוצרי הגברה, ואין צורך להקצות אזורי עבודה מיוחדים לאלקטרופורזה.
מה מציג תמליל PCR כמותי?
מה מתגלה?
באמצעות שיטה כמו PCR כמותי, מוצאים שינויים איכותיים בגנים: הוספות, מחיקות ומוטציות נקודתיות. אבל עם כמה הפרעות תורשתיות, התסמינים התואמים מופיעים בתגובה לשינוי בתוכן של גנים מסוימים.
תודהניתוח כמותי נותן תוצאה מספרית, לרוב ב-IU / ml. המשמעות היא שבמיליליטר אחד מדגימת הבדיקה נמצא מספר מסוים של עותקים של ה-RNA או ה-DNA של הפתוגן, שנמדד ביחידות בינלאומיות.
בהתאם לגודל, חומרת הזיהום מאובחנת. דם נבדק בדרך כלל כדי לקבוע עומס ויראלי, שכן וירוסים נעים בדם בחופשיות במהלך מחלה.
תכונות
PCR כמותי בבדיקת דם כולל שתי תכונות.
- הניתוח מתבצע בנוכחות פריימרים או דיאוקסיריבונוקלאוזיד טריפוספטים, המסומנים בתווית ניאון או רדיואקטיבית כדי לקבוע במדויק את התוכן של תוצר ה-PCR שנוצר.
- בתהליך PCR, סיים את התגובה מוקדם לפני שיופיעו יותר מדי מוצרי PCR. זאת בשל העובדה שבשלב הסופי של הרוויה, כאשר יש הרבה תוצרי PCR, הן האנזים עצמו והן הסובסטרטים משמשים כחוליות המגבילות של תגובה זו. סוף מחזור ה-PCR הבא בתנאים כאלה אינו מאופיין עוד בהכפלה של מספר תוצרי ה-PCR, מפולסים הבדלים כמותיים לא משמעותיים בין דגימות שונות, המוגדרים די ברור בשלבים המוקדמים לאחר שעברו סדרה של מחזורי תגובה..
עלות אבחון PCR
למחקר PCR יש עלות, שתלויה באיזה סוג של זיהום ייבדק, במתודולוגיית הניתוח ובחומר הבדיקה. כדי לקבוע זיהום אחד, תצטרך לתת בפנים200-800 רובל. נוסף גם תשלום עבור נטילת חומר ביולוגי - כ-400 רובל.
